Темнопольний конденсор для мікроскопа. Що Ви знаєте про нього?


  • Переглядів: 6633
  • 0

Ви напевно неодноразово чули про такому методі досліджень живих бактерій, крові та інших біологічних зразків як темнопольная мікроскопія. Але наскільки добре Ви знайомі з цим методом? Чи знаєте Ви, в чому його перевага, принцип роботи, а головне – які вимоги висуваються для його реалізації? У цій статті ми спробували максимально докладно викласти відповіді на багато питань, які можуть виникнути не тільки у пересічного читача, але й побитого досвідом лаборанта.

Короткий зміст статті:

  1. Область застосування методу темного поля.
  2. На чому ґрунтується метод темного поля?
  3. Принцип роботи методу темного поля. Суть методу.
  4. Типи оптичних систем конденсорів темного поля.
  5. Сухий або масляний тип конденсора?
  6. Налаштування конденсора темного поля.
  7. Спостереження дуже дрібних об'єктів, частинок, колоїдних суспензій в темному полі.
  8. Висновок.

 

Область застосування методу темного поля

По-перше, слід сказати, що метод темного поля може бути реалізований як при роботі в прохідному світлі, так і у відбитому світлі. А, по-друге, відзначимо, що найчастіше темнопольная мікроскопія використовується в якості бюджетного альтернативного рішення фазово-контрастної мікроскопії.

Отже, широке практичне застосування методу темного поля в прохідному світлі отримало у багатьох сучасних лабораторіях медичних установ, клінік, фармацевтичних компаній. Так отриманих в нативних препаратах за допомогою цього методу вдається виявити збудники сифілісу, поворотного тифу, лептоспірозу, а також досліджувати рухливість бактерій. Ідеальними «біологічними» кандидатами для проведення досліджень при темнопольном освітленні можна назвати біологічні рідини людини, тварин і рослин, діатомові водорості, водні живі мікроорганізми, дрібні комахи, незабарвлені бактерії, дріжджі. В області колоїдної хімії і мінералогії в якості небіологічних зразків для темнопольної мікроскопії служать мінеральні і хімічні кристали, колоїдні частинки, тонкі зрізи полімерів і кераміки.

Що ж стосується методу темного поля у відбитому світлі, то він може використовуватися, наприклад, при дослідженні шліфів металів.

Конденсоры темного поля

На чому ґрунтується метод темного поля?

Щоб для початку трохи розібратися в суті методу темнопольної мікроскопії можна звернути свій погляд на небо. Як ні парадоксально, але астрономія відмінно підходить для пояснення методу темного поля в мікросвіті. Світ – дійсно великий!

Сяйво зірок на небі ми можемо бачити тільки на темному, чорному небі, після заходу Сонця, коли сонячні промені не висвітлюють небо. Хоча, коли Сонце знаходиться в зеніті, зірки адже нікуди не діваються, вони так само перебувають на небозводі, просто невидны нашим оком, так як яскравість Сонця пригнічує слабке світло від зірок. А ось під час повного сонячного затемнення, коли Місяць проходить між Землею і Сонцем, «блокуючи» його світло, нам вдається побачити зірки. Так можна говорити про те, що можливість бачити зірки, насамперед, обумовлюється різким контрастом між їх слабким світлом і чорним фоном нічного неба.

Саме такий принцип закладено і в мікроскопії темного поля для спостереження нефарбованих прозорих зразків, важко помітних у світлому полі з причини того, що показник заломлення подібних об'єктів близький до коефіцієнта заломлення навколишнього середовища. Наприклад, коефіцієнт заломлення багатьох водних мікроорганізмів варіюється в діапазоні від 1.2 до 1.4, що майже рівнозначно показником заломлення водного середовища. А що ж відбувається при спостереженні нефарбованих непоглинаючих світло зразків у темному полі? Виходять з конденсора косі промені проходять зразок, розсіюються, заломлюються і/або відбиваються від оптично неоднорідних структур (клітинні мембрани, ядро, внутрішні органели). І ці слабосветящиеся промені потрапляють в об'єктив. Таким чином, в результаті ми можемо спостерігати яскраві об'єкти на чорному тлі.

Принцип роботи методу темного поля. Суть методу

Ще раз звернемо увагу на те, що на відміну від традиційного методу спостереження в світлому полі, досліджуваний препарат висвітлюється порожнистим конусом, тобто косими променями збоку, не потрапляють в об'єктив. Таким чином, безпосередньо в микрообъектив потрапляють виключно лише ті промені, що були розсіяні на різних деталях зразка. І саме ці деталі препарату в результаті і буде видно в мікроскоп на чорному тлі.

Щоб реалізувати даний метод освітлення, використовуються спеціальні темнопольные або ж самостійно «апгрейднутый» звичайний світле конденсор Аббе, в якому встановлено додаткове спеціальне центральне перекриття (як це зробити, Ви можете прочитати в статті «Як самостійно зробити конденсор темного поля?»). Однак слід враховувати, що нехитре диафрагмирование звичайного конденсора Аббе істотно послаблює освітленість препарату. З-за багаторазового відбиття від заломлюючих поверхонь у лінзових конденсорах не досягається чорний фон, що призводить до погіршення контрасту зображення, власне визначає перевага даного методу. З цієї причини рекомендується використовувати спеціально розроблені дзеркальні конденсори темного поля.

Типи оптичних систем конденсорів темного поля

Найбільш популярними сучасними дзеркальними конденсорами є конденсор-параболоїд і конденсор-кардиоид. Причому найчастіше для роботи в темному полі базовий конденсор замінюють конденсором-параболоидом, що представляє собою усічену плоско-опуклу параболоидную лінзу з непрозорим перекриттям (блокатором світлових променів) в центрі лінзи і дзеркальною (алюминированной, посрібленою) бічний внутрішньої поверхні конденсора (стінки). Встановлена у центрі стоп-блокада перешкоджає ходу центральних променів і утворює чорне (темний) поле зору. Відображені ж промені падають на бічну дзеркальну поверхню конденсора, знову відображаються і концентруються у фокусі. Вершина параболоїда зрізана на площину, і фокус дзеркала знаходиться над цією площиною, в апланатической площині микрообъектива. Параболічна форма відбиваючої поверхні дозволяє добре виправити сферичну аберацію. Крім того, така оптична система вільна від хроматичної аберації.

темнопольный конденсор-параболоид
На малюнку цифрами позначено: 1 - об'єктив; 2 - препарат, укладений між предметним та покривним склом; 3 - иммерсионное масло; 4 - конденсор-параболоїд; 5 - непрозора перепона

Кардиоид-конденсор є більш досконалою системою, що формує апланатическое зображення. Принцип роботи конденсора-кардіоїда полягає в його властивості відбивати світлові промені за рахунок дзеркал, укладених всередині його корпусу, і таким чином будувати вільний від спотворень світловий конус на площині зразка. На відміну від конденсора-параболоїда, у ньому виправлені не тільки сферична і хроматична аберація, але ще й виконується умова синусів, завдяки чому досягається однакове збільшення для різних зон зіниці, що гарантує усунення коми для малого поля зору. Кардиоид-конденсор являє собою апланатическую двухлинзовую оптичну систему. Однак на практиці такі конденсори виявляються набагато більш чутливі до налаштування: конденсор вимагає ще більш точного центрування, дотримання вимог щодо товщини використовуваних предметних стекол, а також до чистоти скла (відсутність навіть найменших частинок пилу, ворсу тощо).

Темнопольный конденсор-кардиоид
На малюнку цифрами позначено: 1 - об'єктив; 2 - препарат, укладений між предметним та покривним склом; 3 - иммерсионное масло; 4 - конденсор-кардиоид; 5 - увігнуте дзеркало; 6 - опукле дзеркало; 7 - непрозора перепона

Також зустрічаються й інші типи конденсорів: бицентричные, бисферические, кассегрены та ін.

Зведена таблиця оптичних конструкцій конденсорів темного поля:

Оптична система конденсора Числова апертура порожнистого конуса Максимально допустима числова апертура об'єктива Кількість поверхонь, що відбивають Корекція оптичних аберацій
Параболоїд 1.00 - 1.40 0.85 1 параболічна ахроматичный
Кардиоид 1.20 - 1.30 1.05 1 сферична, 1 кардіоїдна ахроматичный/апланатичный
Бицентричный 1.20 - 1.30 1.05 1 кардіоїдна, 1 сферична апланатичный
Бисферичный 1.20 - 1.30 1.05 2 сферичні апланатичный
Кассегрена 1.40 - 1.50 1.30 1 асферична, 1 сферична апланатичный
Спот-кільце (бицентричный) 1.40 - 1.50 1.30 2 сферичні апланатичный
Нельсон Кассегрена 1.30 - 1.45 1.20 1 асферична, 1 сферична апланатичный


Якщо ж перестати писати купу розумних слів про конденсорах і сказати по-простому, то в більшості випадків рядовий лаборант має справу саме з конденсором-параболоидом. А кардиоид – це вже набагато більш складний, а значить і дорогий конденсор, бо не в кожного пересічного лаборанта він заваляется. Мало того, далеко не кожен виробник мікроскопів запропонує кардиоид як опціонально доступних аксесуарів.

Сухий або масляний тип конденсора

Звичайно, збираючись купити конденсор темного поля, перед Вами явно не стоїть завдання у виборі його оптичної конструкції. Насправді все зводиться до того, що, в першу чергу, Вам необхідно знайти конденсор, що відповідає моделі Вашого мікроскопа. Після цього єдиний вибір, який Вам може бути доступний: сухий або масляний. І то, знову-таки, далеко не кожен виробник запропонує Вам навіть такий вибір.

Перше, що кидається в очі – це дуже суттєва різниця у вартості сухих і масляних конденсорів. У зв'язку з чим, цілком закономірно, виникає питання про переваги одного над іншим. Але, насправді, слід розуміти, що різниця між цими типами конденсорів криється не тільки в якості зображення, але і їх призначення. Більш того, вибраний Вами конденсор темного поля може не працювати з об'єктивами, необхідними для Ваших досліджень. Тому слід вивчити це питання більш уважно, ніж Вам цього, може бути, хотілося.

Отже, сухі темнопольные конденсори, як правило, характеризуються числовою апертурою N. A.=0.7-0.9. Враховуючи той факт, що числова апертура конденсора темного поля повинна перевершувати числову апертуру об'єктива, щоб виключити потрапляння прямих променів в микрообъектив і, відповідно, засвічення препарату, що суперечить самій суті методу, такий тип конденсорів допускає роботу виключно з малоапертурными об'єктивами. Таким чином, найбільш потужний об'єктив, який допускає роботу з конденсор темного поля сухого типу – це 40-кратний об'єктив, N. A. якого складає 0.65.

Кровь в темном поле
Кров у темному полі. Об'єктив 40х, сухий конденсор 0.7-0.9

Олійні конденсори являють собою высокоапертурные системи і призначені для роботи з об'єктивами від 20х і вище. Такі конденсори вимагають обов'язкового використання иммерсионного масла між лінзою конденсора і предметним склом при роботі з об'єктивами будь кратності, сухими або ж иммерсионными. Не нанесення иммерсионного масла на лінзу конденсора послужить перешкодою тому, щоб світлові промені досягли зразка. Косий порожнистий світловий конус, що формується даним типом конденсорів, не зможе вийти з фронтальної лінзи конденсора без використання масла, і буде повністю відображений назад в конденсор. Світло, що випромінюється джерелом світла, що відбивається від дзеркальних поверхонь всередині конденсора і виходить через верхню лінзу конденсора під набагато більшими кутами нахилу, ніж критичний кут для межі поділу повітря-скло (близько 41 град.). У разі масляних конденсорів-параболоїдів та ін. з таблиці, де коефіцієнт заломлення однаковий для лінз конденсора, иммерсионного масла і скла препарату, світло, що виходить з конденсора, проходить через зразок непреломленным поверхнями повітря-скло.

Кровь в темном поле
Кров у темному полі. Об'єктив 40х, масляний конденсор 1.25-1.36

Числова апертура багатьох олійних конденсорів становить 1.25-1.36, але може досягати і 1.5 в теорії (хоча на практиці такого високого значення домогтися вкрай складно). При цьому в обов'язковому порядку повинне дотримуватися правило: N. A. об'єктива повинна бути строго менше N. A. конденсора. Саме з цієї причини, якщо для проведення досліджень планується використовуватися высокоапертурные об'єктиви, зокрема 100х, необхідно переконатися, що такий об'єктив оснащений вбудованою апертурної діафрагми для «відсікання» частини апертури. Так, наприклад, прийнято вважати, що для конденсора-параболоїда максимально допустима числова апертура об'єктива становить 0.85, для конденсора-кардіоїда – 1.05. Тому зверніть увагу, що звичайний, хоч навіть самий якісний об'єктив 100х, але має апертуру 1.25 НЕ БУДЕ працювати ні з естетичної, ні з масляним конденсором! Для цього необхідно придбати об'єктив зі спеціальною відсікає діафрагмою. І працювати такий об'єктив буде тільки в масляному конденсорі.

Слід згадати і те, що зменшуючи числову апертуру об'єктива за допомогою інтегрованої ірисової діафрагми, знижується і його роздільна здатність, що також важливо враховувати при проведенні досліджень.

Говорячи про якості зображення, то, по-перше, сухі конденсори темного поля забезпечують чітке зображення лише в центрі, в той час як в імерсійним – зображення у фокусі майже на всій ділянці. Крім того, олійні конденсори забезпечують набагато кращу контрастність і деталізацію. У сухому конденсорі зображення як ніби злегка затягнуте білястою пеленою, воно «глядабельних», але якщо тут же заглянути в мікроскоп з темнопольним масляним конденсором, Ви відразу ж віддасте перевагу йому, зможе зупинити лише ціна і бюджет покупця.

Налаштування конденсора темного поля

Незалежно від того, використовуєте Ви сухий або масляний тип конденсора, для реалізації його оптимальної роботи спочатку його необхідно належним чином центрувати щодо оптичного мікроскопа. З цією метою конденсори темного поля оснащені двома юстирувальними гвинтами. Центрування виконується, починаючи з малих збільшень (об'єктиви 10х/20х). Щоб допомогти у виконанні юстування, на верхній лінзі конденсора може бути спеціально розташований невеликий гурток.

Для роботи в темному полі мікроскоп повинен бути оснащений потужним джерелом освітлення, польова і апертурні діафрагми повністю розкриті, ніякі фільтри не повинні бути встановлені на оптичному шляху.

Конденсор темного поля

При нанесенні масла на лінзу высокоапертурного конденсора слід бути максимально обережним, щоб уникнути утворення маленьких бульбашок. Фактично, техніка повинна бути доведена до виняткової досконалості. Бульбашки повітря призведуть до появи паразитних відблисків і деформації, що, в свою чергу, стане причиною зниження контрасту і погіршення якості зображення в цілому.

Також слід використовувати предметні і покривні скла відповідної товщини. Занадто тонкі або дуже товсті скла ускладнять фокусування конденсора.

Спостереження дуже дрібних об'єктів, частинок, колоїдальних суспензій в темному полі

Цікаво, що метод спостереження у темному полі дозволяє виявити навіть об'єкти, розміри яких істотно менше роздільної здатності об'єктива. Розсіяний частками світло проходить через об'єктив і стає видимим як яскраві дифракційні диски. Кожна частинка видно як крихітний дифракційний диск, забезпечуючи горизонтальне відстань до знаходяться поруч частинок більше, ніж дозвіл микрообъектива. Зі збільшенням яскравості освітлення оптична різниця між крихітними частинками та їх заднім чорним фоном зростає. При цьому навіть ще більш дрібні частинки (помітні окремо завдяки своїй здатності розсіювати світло) розсіюють достатньо світла, щоб стати видимими, і суспендовані частинки видно навіть за умови, що їх діаметр менше 40нм, тобто в 5 разів менше ніж межа дозволу (0.2 мкм) иммерсионного об'єктива з найвищою числовою апертурою. В біології з допомогою высокоапертурных конденсорів темного поля вдається спостерігати рух живих бактерій джгутиків, розмір яких у середньому становить 20нм в діаметрі.

Висновок

Темне поле дозволяє виявити приховані в світлому полі обриси, межі, контури, градієнт показника заломлення.

Темнопольная мікроскопія продовжує грати дуже важливу роль в мікробіологічних дослідженнях в області біології, медицини, фармацевтики. Даний метод ефективно використовується для мікрофотографії з великими збільшеннями живих бактерій, а також для візуального спостереження клітин, тканин і цілих організмів (тотальних препаратів) при невеликих збільшеннях. Морські біологи використовують темнопольное освітлення для дослідження на невеликих кратностях і запису даних про організми в чистій і солоній воді, наприклад, таких як морські водорості і планктон.

Автор статті (текст і фото): Галина Цехмістро

 

Рекомендуємо

Конденсор темного поля Delta Optical для DO Evolution 200/300 масляний
5 214грн.
Немає в наявності Модель: 940-02
Конденсор темного поля Ulab для XY-B2
3 405грн.
Немає в наявності Модель: 102066-21
Конденсор темного поля Ulab для XSP-138, XSP-139
946грн.
Немає в наявності Модель: 102065-21
Конденсор темного поля Ulab для XSP-137
684грн.
Немає в наявності Модель: 102725-21
Конденсор темного поля MICROmed
5 373грн.
Немає в наявності Модель: 100941-09
Конденсор темного поля Konus
1 195грн.
Немає в наявності Модель: 100400-04
Конденсор темного поля Delta Optical для DO Genetic Pro/Evolution 100 сухий
2 943грн.
На складі Модель: 100937-02
Конденсор темного поля Delta Optical для DO Genetic Pro/Evolution 100 масляний
5 373грн.
На складі Модель: 100938-02
Залишити відгук  ↓
 
Ще ніхто не залишив відгуків.