Темнопольный конденсор для микроскопа. Что Вы знаете о нем?

Вы точно неоднократно слышали о таком методе исследований живых бактерий, крови и других биологических образцов как темнопольная микроскопия. Но насколько хорошо Вы знакомы с этим методом? Знаете ли Вы, в чем его преимущество, принцип работы, а главное – какие требования выдвигаются для его реализации? В этой статье мы попробовали максимально подробно изложить ответы на многие вопросы, которые могут возникнуть не только у рядового читателя, но и избитого опытом лаборанта.

Краткое содержание статьи:

1. Область применения метода темного поля.
2. На чем основывается метод темного поля?
3. Принцип работы метода темного поля. Суть метода.
4. Типы оптических систем конденсоров темного поля.
5. Сухой или масляный тип конденсора?
6. Настройка конденсора темного поля.
7. Наблюдение очень мелких объектов, частиц, коллоидных суспензий в темном поле.
8. Заключение.

Область применения метода темного поля

Во-первых, следует сказать, что метод темного поля может быть реализован как при работе в проходящем свете, так и в отраженном свете. А, во-вторых, отметим, что зачастую темнопольная микроскопия используется в качестве бюджетного альтернативного решения фазово-контрастной микроскопии.

Итак, широкое практическое применение метода темного поля в проходящем свете получило во многих современных лабораториях медицинских учреждений, клиник, фармацевтических компаний. Так в полученных нативных препаратах с помощью данного метода удается обнаружить возбудители сифилиса, возвратного тифа, лептоспироза, а также исследовать подвижность бактерий. Идеальными «биологическими» кандидатами для проведения исследований при темнопольном освещении можно назвать биологические жидкости человека, животных и растений, диатомовые водоросли, живые водные микроорганизмы, мелкие насекомые, неокрашенные бактерии, дрожжи. В области коллоидной химии и минералогии в качестве небиологических образцов для темнопольной микроскопии служат минеральные и химические кристаллы, коллоидные частицы, тонкие срезы полимеров и керамики.

Что же касается метода темного поля в отраженном свете, то он может использоваться, например, при исследовании шлифов металлов.

На чем основывается метод темного поля?

Чтобы для начала немного разобраться в сути метода темнопольной микроскопии можно обратить свой взор на небо. Как ни парадоксально, но астрономия отлично подходит для объяснения метода темного поля в микромире. Мир – действительно велик!

Сияние звезд на небе мы можем видеть только на темном, «черном» небе, после захода Солнца, когда солнечные лучи не освещают небо. Хотя, когда Солнце находится в зените, звезды ведь никуда не деваются, они все так же находятся на небосводе, просто невидны нашим глазом, так как яркость Солнца подавляет слабый свет от звезд. А вот во время полного солнечного затмения, когда Луна проходит между Землей и Солнцем, «блокируя» его свет, нам удается увидеть звезды. Так можно говорить о том, что возможность видеть звезды, прежде всего, обуславливается резким контрастом между их слабым светом и черным фоном ночного неба.

Именно такой принцип заложен и в микроскопии темного поля для наблюдения неокрашенных прозрачных образцов, трудно различимых в светлом поле по причине того, что показатель преломления подобных объектов близок к коэффициенту преломления окружающей среды. Например, коэффициент преломления многих водных микроорганизмов варьируется в диапазоне от 1.2 до 1.4, что почти равнозначно показателю преломления водной среды. А что же происходит при наблюдении неокрашенных непоглощающих свет образцов в темном поле? Выходящие из конденсора косые лучи проходят образец, рассеиваются, преломляются и/или отражаются от оптически неоднородных структур (клеточные мембраны, ядро, внутренние органеллы). И эти слабосветящиеся лучи попадают в объектив. Таким образом, в результате мы можем наблюдать яркие объекты на черном фоне.   

Принцип работы метода темного поля. Суть метода

Еще раз обратим внимание на то, что в отличие от традиционного метода наблюдения в светлом поле, исследуемый препарат освещается полым конусом, то есть косыми лучами сбоку, не попадающими в объектив. Таким образом, непосредственно в микрообъектив попадают исключительно лишь те лучи, которые были рассеяны на различных деталях образца. И именно эти детали препарата в итоге и будут видны в микроскоп на черном фоне.

Чтобы реализовать данный метод освещения, используются либо специальные темнопольные либо же самостоятельно «апгрейднутый» обычный светлопольный конденсор Аббе, в котором установлено дополнительное специальное центральное перекрытие (как это сделать, Вы можете прочитать в статье «Как самостоятельно сделать конденсор темного поля?»). Однако следует учитывать, что незатейливое диафрагмирование обычного конденсора Аббе существенно ослабляет освещенность препарата. Из-за многократного отражения от преломляющих поверхностей в линзовых конденсорах не достигается черный фон, что приводит к ухудшению контраста изображения, собственно определяющего преимущество данного метода. По этой причине рекомендуется использовать специально разработанные зеркальные конденсоры темного поля.

Типы оптических систем конденсоров темного поля

Наиболее популярными современными зеркальными конденсорами являются конденсор-параболоид и конденсор-кардиоид. Причем чаще всего для работы в темном поле базовый конденсор заменяют конденсором-параболоидом, представляющим собой усеченную плоско-выпуклую параболоидную линзу с непрозрачным перекрытием (блокатором световых лучей) в центре линзы и зеркальной (алюминированной, посеребренной) боковой внутренней поверхности конденсора (стенки). Установленная в центре стоп-блокада препятствует ходу центральных лучей и образует черное (темное) поле зрения. Отраженные же лучи падают на боковую зеркальную поверхность конденсора, снова отражаются и концентрируются в фокусе. Вершина параболоида срезана на плоскость, и фокус зеркала находится над этой плоскостью, в апланатической плоскости микрообъектива. Параболическая форма отражающей поверхности позволяет хорошо исправить сферическую аберрацию. Кроме того, такая оптическая система свободна от хроматической аберрации.

На рисунке цифрами обозначено: 1 - объектив; 2 - препарат, заключенный между предметным и покровным стеклом; 3- иммерсионное масло; 4- конденсор-параболоид; 5 - непрозрачная преграда

Кардиоид-конденсор является более совершенной системой, формирующей апланатическое изображение. Принцип работы конденсора-кардиоида заключается в его свойстве отражать световые лучи за счет зеркал, заключенных внутри его корпуса, и таким образом строить свободный от искажений световой конус на плоскости образца. В отличие от конденсора-параболоида, в нем исправлены не только сферическая и хроматическая аберрация, но еще и выполняется условие синусов, благодаря чему достигается одинаковое увеличение для разных зон зрачка, что гарантирует устранение комы для малого поля зрения. Кардиоид-конденсор представляет собой апланатическую двухлинзовую оптическую систему. Однако  на практике такие конденсоры оказываются гораздо более чувствительны к настройке: конденсор требует еще более точной центровки, соблюдения требований в отношении толщины используемых предметных стекол, а также к чистоте стекол (отсутствие даже малейших пылинок, ворсинок и т.п.).

На рисунке цифрами обозначено: 1 - объектив; 2 - препарат, заключенный между предметным и покровным стеклом; 3- иммерсионное масло; 4- конденсор-кардиоид; 5 - вогнутое зеркало; 6 - выпуклое зеркало; 7 - непрозрачная преграда

Также встречаются и другие типы конденсоров: бицентричные, бисферические, кассегрены и др.

Сводная таблица оптических конструкций конденсоров темного поля:

Если же перестать писать кучу умных слов о конденсорах и сказать по-простому, то в большинстве случаев рядовой лаборант имеет дело именно с конденсором-параболоидом. А кардиоид – это уже гораздо более  сложный, а значит и дорогой конденсор, потому не у каждого рядового лаборанта он заваляется. Мало того, далеко не каждый производитель микроскопов предложит кардиоид в качестве опционально доступных аксессуаров.

Сухой или масляный тип конденсора

Конечно, собираясь купить конденсор темного поля, перед Вами явно не стоит задача в выборе его оптической конструкции. На самом деле все сводится к тому, что, в первую очередь, Вам необходимо найти конденсор, соответствующий модели Вашего микроскопа. После этого единственный выбор, который Вам может быть доступен:  сухой или масляный. И то, снова-таки, далеко не каждый производитель предложит Вам даже такой выбор.

Первое, что бросается в глаза – это очень существенная разница в стоимости сухих и масляных конденсоров. В связи с чем, вполне закономерно, возникает вопрос о преимуществах одного над другим. Но, на самом деле, следует понимать, что разница между этими типами конденсоров кроется не только в качестве изображения, но и в их назначениях. Более того, выбранный Вами конденсор темного поля может не работать с объективами, необходимыми для Ваших исследований. Поэтому следует изучить этот вопрос более внимательно, чем Вам этого, может быть, хотелось.

Итак, сухие темнопольные конденсоры, как правило, характеризуются числовой апертурой N.A.=0.7-0.9. Учитывая тот факт, что числовая апертура конденсора темного поля должна превосходить числовую апертуру объектива, чтобы исключить попадание прямых лучей в микрообъектив и, соответственно, засветку препарата, что противоречит самой сути метода, такой тип конденсоров допускает работу исключительно с малоапертурными объективами. Таким образом, наиболее мощный объектив, который допускает работу с конденсором темного поля сухого типа – это  40-кратный объектив, N.A. которого составляет 0.65.

Кровь в темном поле. Объектив 40х, сухой конденсор 0.7-0.9

Масляные конденсоры представляют собой высокоапертурные системы и предназначены для работы с объективами от 20х и выше. Такие конденсоры требуют обязательного использования иммерсионного масла между линзой конденсора и предметным стеклом при работе с объективами любой кратности, сухими или же иммерсионными. Не нанесение иммерсионного масла на линзу конденсора послужит препятствием тому, чтобы световые лучи достигли образца. Косой полый световой конус, формируемый данным типом конденсоров, не сможет выйти из фронтальной линзы конденсора без использования масла, и будет полностью отражен обратно в конденсор. Свет, излучаемый источником освещения, отражается от зеркальных поверхностей внутри конденсора и выходит через верхнюю линзу конденсора под гораздо большими углами наклона, чем критический угол для границы раздела воздух-стекло (около 41 град.). В случае масляных конденсоров-параболоидов и др. из таблицы, где коэффициент преломления одинаков для линзы конденсора, иммерсионного масла и стекла препарата, свет, выходящий из конденсора, проходит через образец непреломленным поверхностями воздух-стекло.

Кровь в темном поле. Объектив 40х, масляный конденсор 1.25-1.36

Числовая апертура многих масляных конденсоров составляет 1.25-1.36, но может достигать и 1.5 в теории (хотя на практике столь высокого значения добиться крайне сложно). При этом в обязательном порядке должно соблюдаться правило:  N.A. объектива должна быть строго меньше N.A. конденсора. Именно по этой причине, если для проведения исследований планируется использоваться высокоапертурные объективы, в частности 100х, необходимо убедиться, что такой объектив оснащен встроенной апертурной диафрагмой для «отсечения» части апертуры. Так, например, принято считать, что для конденсора-параболоида максимально допустимая числовая апертура объектива составляет 0.85, для конденсора-кардиоида – 1.05. Поэтому обратите внимание, что обычный, хоть даже самый качественный объектив 100х, но имеющий апертуру 1.25 НЕ БУДЕТ работать ни с сухим, ни с масляным конденсором! Для этого необходимо приобрести объектив со специальной отсекающей диафрагмой. И работать такой объектив будет только в масляном конденсоре.

Следует упомянуть и то, что уменьшая числовую апертуру объектива с помощью интегрированной ирисовой диафрагмы, снижается и его разрешающая способность, что также важно учитывать при проведении исследований.

Говоря о качестве изображения, то, во-первых, сухие конденсоры темного поля обеспечивают четкое изображение лишь в центре, в то время как в иммерсионных – изображение в фокусе почти на всем участке. Кроме того, масляные конденсоры обеспечивают и гораздо лучшую контрастность и детализацию. В сухом конденсоре изображение как будто затянуто слегка белесой пеленой, оно «смотрибельное», но если тут же заглянуть в микроскоп с темнопольным масляным конденсором, Вы  сразу же отдадите предпочтение ему, остановить сможет лишь цена и бюджет покупателя.

Настройка конденсора темного поля

Независимо от того, используете Вы сухой или масляный тип конденсора, для реализации его оптимальной работы сначала его необходимо должным образом центрировать относительно оптического пути микроскопа. С этой целью конденсоры темного поля оснащены двумя юстировочными винтами. Центровка выполняется, начиная с малых увеличений (объективы 10х/20х). Чтобы помочь в выполнении юстировки, на верхней линзе конденсора может быть специально расположен небольшой кружок.

Для работы в темном поле микроскоп должен быть оснащен мощным источником освещения, полевая и апертурные диафрагмы полностью раскрыты, никакие фильтры не должны быть установлены на оптическом пути.

При нанесении масла на линзу высокоапертурного конденсора следует быть максимально аккуратным, чтобы избежать образования маленьких пузырьков. Фактически, техника должна быть доведена до исключительного совершенства. Пузырьки воздуха приведут к появлению паразитных бликов и дисторсии, что, в свою очередь, станет причиной снижения контраста и ухудшения качества изображения в целом.

Также следует использовать предметные и покровные стекла соответствующей толщины. Слишком тонкие или слишком толстые стекла затруднят фокусировку конденсора.

Наблюдение очень мелких объектов, частиц, коллоидальных суспензий в темном поле

Интересно, что метод наблюдения в темном поле позволяет обнаружить даже объекты, размеры которых существенно меньше разрешающей способности объектива. Рассеянный частицами свет проходит через объектив  и становится видимым как яркие дифракционные диски. Каждая частица видна как крошечный дифракционный диск, обеспечивая горизонтальное расстояние до находящихся рядом частиц больше, чем разрешение микрообъектива. С увеличением яркости освещения оптическая разница между крошечными частицами и их задним черным фоном возрастает. При этом даже еще более мелкие частицы (различимые отдельно благодаря своей способности рассеивать свет) рассеивают достаточно света, чтобы стать видимыми, и суспендированные частицы видны даже при условии, что их диаметр меньше 40нм, то есть в 5 раз меньше чем предел разрешения (0.2мкм) иммерсионного объектива с самой высокой числовой апертурой. В биологии с помощью высокоапертурных конденсоров темного поля удается наблюдать движение живых бактерий жгутиков, размер которых в среднем составляет 20нм в диаметре.

Заключение

Темное поле позволяет обнаружить скрытые в светлом поле очертания, грани, контуры, градиенты показателя преломления.

Темнопольная микроскопия продолжает играть очень важную роль в микробиологических исследованиях в области биологии, медицины, фармацевтики. Данный метод эффективно применяется для микрофотографии с большими увеличениями живых бактерий, а также для визуального наблюдения клеток, тканей и целых организмов (тотальных препаратов) при небольших увеличениях. Морские биологи используют темнопольное освещение для исследования на небольших кратностях и записи данных об организмах в чистой и соленой воде, например, таких как морские водоросли и планктон.

Автор статьи (текст и фото): Галина Цехмистро