Измерение объектов с помощью микроскопа

Помимо лишь визуальных наблюдений исследуемых микрообразцов микроскопы также позволяют проводить различные микроскопические измерения объектов, среди которых, естественно, определение линейных размеров образца и его толщины. Безусловно, с помощью микроскопов проводят и множество других измерений, выполнений анализов, подсчетов элементов и др. Но в данной статье мы охватим лишь некоторые наиболее популярные, с нашей точки зрения, микроскопические измерения.

Измерение толщины объекта.

Итак, задавались ли Вы вопросом, что это за такая шкала на микровинтах лабораторных биологических, металлографических  и многих других типов микроскопов? Для чего она нужна? Хоть и предполагается, что под биологическим микроскопом исследуют прозрачные плоские образцы, все же в терминах микроскопии, такой образец  (например, гистологический срез) может иметь некоторую толщину, пусть и измеряемую в микрометрах. Естественно, если же говорить об исследовании минералов, горных пород, руд, металлов и сплавов, то такие объекты, очевидно, будут иметь какие-то углубления, трещины и пр. Собственно-то, ввиду неоднородности объекта при наблюдениях в микроскоп одни детали будут в фокусе, другие же – расфокусированные.

Итак, верхней поверхности образца, его выступу, соответствует одно положение микровинта настройки фокуса, а нижней поверхности образца, его углублению, впадине – другое положение микровинта. Нетрудно догадаться, что сравнив эти два положения микровинта и определив их разность, мы сможем вычислить толщину объекта. Используя шкалу микровинта, можно легко вычислить данную величину. Теперь становится вопрос о калибровке микровинта. Как правило, деления шкалы микровинта в лабораторных микроскопах соответствуют 1 и 2 микрометрам. Данные о шаге винта точной фокусировки, обычно, должны быть указаны производителем в инструкции к прибору. Если же Вам не удается найти данную информацию, Вы можете самостоятельно выполнить калибровку по любому образцу известной толщины, например, для этого может быть использовано покровное стекло.

При наблюдении в иммерсионные объективы данная величина и будет составлять толщину объекта. А вот с использованием сухих объективов полученное значение необходимо умножить на коэффициент 1.5, представляющий собой соотношение между коэффициентами преломления стекла и воздуха.

К сожалению, на точность данного метода влияют возможные сферическая аберрация и артефакты рефракции. Но в целом же, метод обеспечивает довольно неплохую точность измерений.

Измерение ширины и длины объекта с помощью окуляра-микрометра и объекта-микрометра.

Зачастую перед лаборантом также стоит задача установить линейные размеры отдельных микроэлементов и частиц исследуемого препарата. Для выполнения подобной задачи микроскоп необходимо оснастить специальным окуляром со шкалой или сеткой – окуляром-микрометром, и калибровочной линейкой-слайдом – объектом-микрометром. С помощью данных аксессуаров можно определить длину и ширину объекта в микрометрах (микронах).

*Заметка 1. Кстати, обратим внимание, что, независимо от того, используется монокулярный, бинокулярный или тринокулярный микроскоп, для выполнения микрометрических измерений необходим лишь один микрометрический окуляр. Т.е. в случае бино- или тринонасадки, нет необходимости в установке еще одного микрометрического окуляра во второй окулярный тубус. Более того, это было бы даже серьезной ошибкой, так как не позволило бы лаборанту видеть единую цельную картинку шкалы.

Окуляр-микрометр представляет собой специальный окуляр, в котором в плоскости полевой диафрагмы окуляра (в плоскости промежуточного изображения) установлено дополнительное стеклышко с разметкой – шкалой для выполнения микрометрических измерений, вычисления длины и ширины частиц, величины зерна, глубины слоя (азотирования, цементации), размера микродефектов.

Цена деления самого окуляра-микрометра составляет 0,1мм. При наблюдении же в микроскоп цена деления зависит от конкретной комбинации окуляра и объектива, а также от длины тубуса микроскопа. Так, в идеальных условиях при выборе 100х объектива мы бы получили цену деления 0,001мм (1 микрометр). Методом интерполяции нетрудно было бы получить, что:

• 100х объектив и 10х окуляр-микрометр => цена деления 0,001мм=1мкм
• 40х объектив и 10х окуляр-микрометр => цена деления 0,0025мм
• 20х объектив и 10х окуляр-микрометр => цена деления 0,005мм
• 10х объектив и 10х окуляр-микрометр => цена деления 0,01мм
• 4х объектив и 10х окуляр-микрометр => цена деления 0,025мм

Однако же, при производстве объективов принято считать допустимую погрешность увеличения в пределах 2-2.5%. Так, 100х объектив по факту может оказаться 97.5х или 102.5х. Но лаборанту не будет это известно до тех пор, пока не будет выполнена калибровка. По этой причине лаборанты вынуждены самостоятельно выполнять калибровку окуляра-микрометра для каждого объектива с помощью такого аксессуара, как объект-микрометр. И так как каждый объектив может иметь определенную погрешность увеличения, то ни о какой интерполяции на практике не может быть и речи.

Объект-микрометр представляет собой специальное предметное стекло (пластину) со шкалой. В большинстве случаев, шкала выполнена в виде линейки длиной 1мм, разделенной на десятые и сотые доли. Цена деления такой линейки равна 0.01мм. Но встречаются и модели с ценой 0.1мм, а также есть необычные калибровочные слайды со специальными оригинальными сетками, окружностями, перекрестиями и т.п.

Итак, разместив объект-микрометр на предметном столике микроскопа, можно легко и просто выполнить калибровку окуляра-микрометра. Настроив резкость (фокус) при заданном объективе в микроскопе четко видны две сетки: сетка окуляра-микрометра и сетка объекта-микрометра. Поворачивая окуляр-микрометр в окулярном тубусе, и перемещая калибровочный слайд в плоскости предметного столика с помощью препаратоводителя, необходимо добиться того, чтобы штрихи-деления сеток окуляра и калибровочной линейки находились параллельно друг другу. Определив, сколько делений шкалы объекта-микрометра укладывается в шкале окуляра-микрометра для объективов большого и среднего увеличения, или, наоборот, для объективов малого увеличения, можно вычислить и непосредственно цену деления окуляра-микрометра по совершенно несложной математической формуле:

Цок= N*Цоб/K,

где Цок - цена деления окуляра-микрометра, Цоб – цена деления объектива-микрометра, N – число делений объектива-микрометра, K – число делений окуляра-микрометра.

Так, например:

Если лаборант все время работает за одним микроскопом, то ему вполне достаточно единожды выполнить подобную поверку-калибровку для каждого объектива, запротоколировать у себя полученные данные и использовать их в дальнейшем.

*Заметка 2. Учтите, что в случае, если микроскоп оснащен специальными объективами с механизмом коррекции на толщину покровного стекла, то все сравнительные микроскопические измерения следует выполнять при одинаковой настройке такого корректирующего устройства.

*Заметка 3. Кстати, определять линейные размеры микроэлементов образца также можно и с помощью специальной цифровой камеры для микроскопа и соответствующего программного обеспечения. Объект-микрометр также используется для калибровки цифровой камеры для каждого объектива отдельно согласно инструкции к камере.

Определение линейной меры микрообъекта с помощью координатного столика, препаратоводителя и шкалы нониуса.

Также в лабораторных микроскопах, оснащенных координатным столиком, предусмотрена возможность определения линейных размеров (длины/ширины) микрообъектов с помощью шкалы нониуса. Допустимы точные измерения от 0,1мм и приблизительные – до 0.05мм. С этой целью в окулярные тубусы микроскопа должны быть установлены окуляры с перекрестием либо с указателем. Аккуратно поворачивая винты координатного перемещения образца, добиваются совпадения точки измеряемого объекта, принимая ее за исходную точку отсчета, с перекрестием. При этом фиксируется показание шкалы нониуса. Далее перемещением препаратоводителя по оси Х или по оси У (продольным либо поперечным перемещением) передвигаются к конечной точке отсчета, после чего устанавливают и фиксируют новые показания шкалы. Подсчитав разность установленных показаний, находят соответствующие линейные размеры исследуемого препарата.

Кроме того, существуют и ряд других микроскопических измерений, выполняемых, например, с помощью специальных счетных камер. Но это уже темы для других статей.
 

Автор статьи (текст и фото): Галина Цехмистро