Настройка освещения по Келлеру. Видеоурок

Современные лабораторные микроскопы профессионального уровня предусматривают специальную методику настройки освещения по Кёллеру. Впервые подобный принцип освещения был предложен в 1893г. немецким профессором Августом Кёллером, сотрудником компании Carl Zeiss, и с тех пор широко применяется в области традиционной микроскопии. Техника настройки освещения по Кёллеру позволяет добиться наилучшего разрешения и контраста для визуальных наблюдений, и особенно важна для микрофотографии. Естественно, настройка освещения по Кёллеру используется в биологических микроскопах при наблюдениях в светлом поле, при этом играя более критически важную роль при проведении исследований специальными методами, например, фазово-контрастной микроскопии.

Важно помнить, что настройка освещения по Кёллеру должна производиться для каждого объектива отдельно. Кроме того, не меньшую роль играют и толщина используемого предметного стекла, и непосредственно сам образец. Так, в случае если лаборатория работает исключительно со стандартизированными стеклами одной толщины и одним типом образцов, проводя исследования, например, именно со 100х объективом (например, лаборатория, занимающаяся гистологическими исследованиями), то в таком случае будет вполне достаточно единожды выполнить настройку. В противном же случае, Вам придется выполнять рутинную процедуру настройки освещения снова и снова.

Итак, вывод 1. Настройка освещения по Кёллеру осуществляется, исходя из трех факторов:

• Фактор 1 – используемый объектив
• Фактор 2 – толщина предметного стекла
• Фактор 3 – физические свойства исследуемого препарата

*Заметка 1. Обратим внимание, что правильная настройка освещения по Кёллеру играет более критическую роль при наблюдениях с объективами сухого типа, чем с масляными объективами.

К сожалению, не все современные лабораторные микроскопы имеют возможность настройки освещения по Кёллеру. Поэтому при выборе профессионально микроскопа следует обращать внимание на наличие:

1. Юстируемого по высоте и центрируемого конденсора
2. Апертурной диафрагмы конденсора
3. Полевой диафрагмы линзы коллектора

Как же собственно выполнить настройку освещения по Кёллеру?

Пошаговая инструкция настройки освещения по Келлеру

Шаг 1. Устанавливаем микроскоп на рабочий стол и подключаем его к сети. Включаем источник освещения.

Шаг 2. В препаратодержателе координатного столика микроскопа фиксируем предметное стекло с  образцом, окрашенным должным образом. Убедимся, что предметное стекло расположено ровно, без перекосов слегка придавив его по обеим сторонам.

*Заметка 2. Не следует прикладывать слишком много усилий при нажатии на предметное стекло, чтобы не повредить механизм перемещения столика вверх/вниз.

Шаг 3. Необходимо полностью открыть полевую диафрагму линзы коллектора и апертурную диафрагму конденсора ирисового типа вращением соответствующих регулировочных колец или рычагов.

Шаг 4. Конденсор микроскопа следует аккуратно поднять вверх до упора, используя соответствующий регулировочный механизм (ручка либо рычаг), как правило, расположенные слева под предметным столиком.

*Заметка 3. Обратите внимание, что конденсор не должен упираться в предметное стекло, так как может попросту сместить его из препаратодержателя. Как правило, производители оптических приборов предусматривают ограничитель поднятия конденсора максимально вверх, так что заводская настройка и не позволит линзе конденсора соприкоснуться с предметным стеклом. В то же время, случается, что линза конденсора случайно вывинчена и упирается в предметное стекло, в таком случае необходимо аккуратно закрутить линзу обратно.

*Заметка 4. Большинство микроскопов оснащено конденсорами единой конструкции, однако встречаются и модели с конденсорами с откидной фронтальной линзой (например, микроскопы Konus Biorex-3, Konus Infinity-3, Ulab XY-B2T и др.) либо же дополнительной нижней линзой (например, микроскоп Bresser Science TRM-301), вводящимися или выводящимися из хода лучей соответствующим образом. Установленная наверх откидная фронтальная линза уменьшает фокусное расстояние конденсора, в то время как дополнительная нижняя линза, наоборот, увеличивает его фокусное расстояние, что, в свою очередь, естественно, влияет на размер изображения апертурной диафрагмы в плоскости препарата. В таких случаях, выполняя процедуру настройки освещение по Кёллеру для объективов малых увеличений, следует откинуть верхнюю откидную линзу коллектора, либо же ввести нижнюю дополнительную линзу.

Шаг 5. Выбираем объектив, для которого будет проводиться настройка освещения по Кёллеру. Обратим внимание, что, как правило, объективы малых увеличений 4х и 10х в лабораториях используются не для непосредственного проведения исследования, а лишь для поиска препарата и центрирования его в поле зрения. Таким образом, наблюдения обычно проводятся, постепенно переходя от объективов с малыми увеличениями к объективам с большей кратностью. Наиболее часто первым объективом для настройки освещения по Кёллеру принято выбирать 10х объектив.

Шаг 6. Наблюдая в окуляры микроскопа регулируем кольцо реостата источника освещения для достижения наиболее комфортной для глаз интенсивности освещения препарата так, чтобы освещение и не слепило, но и картинка не была темной.

Шаг 7. Используем ручки грубой и точной фокусировки для настройки максимально возможной резкости изображения препарата.

Шаг 8. Полностью закрываем полевую диафрагму линзы коллектора вращением соответствующего регулировочного кольца. При этом необходимо убедиться, что в окуляры будет видно изображение полевой диафрагмы или ее часть.

Шаг 9. С помощью механизма юстировки конденсора по высоте опускаем его вниз до тех пор, пока не увидим резкое изображение полевой диафрагмы, т.е. четко очерченные контуры многоугольника.

Шаг 10. В результате выполнения предыдущего шага мы можем обнаружить, что наш многоугольник находится вовсе не в центре поля зрения микроскопа, что говорит о необходимости центрирования конденсора с помощью двух юстировочных винтов, расположенных в оправе-держателе конденсора. Таким образом, необходимо добиться расположения полевой диафрагмы по центру как можно более точно.

*Заметка 5. Выполняя центрирование конденсора, будьте осторожны и не сместите его положение, установленное по высоте.

Шаг 11. Успешно завершив центрирование конденсора, следует аккуратно приоткрыть полевую диафрагму так, чтобы края многоугольника почти выходили за границу поля зрения.

*Заметка 6. При необходимости следует немного подкорректировать центровку конденсора.

Убедившись в должной центровке конденсора, раскройте полевую диафрагму ровно на столько, чтобы освещалось все видимое поле зрения, но не более. Полностью раскрывать полевую диафрагму не следует, так как это может привести к ухудшению качества изображения, в частности к снижению контрастности из-за чрезмерной засветки.

Шаг 12. Последним пунктом настройки является регулировка апертурной диафрагмы конденсора. Считается, что для достижения наилучшего контраста без потери разрешения и деталей изображения апертурная диафрагма должна быть открыта на ≈65-80% от числовой апертуры объектива. Часто для такой настройки из окулярного тубуса микроскопа вынимают окуляр и, наблюдая на расстоянии 10-20см, регулируют диаметр апертурной диафрагмы так, чтобы осветить около ≈65-80%  диаметра зрачка.

*Заметка 7. Описанный выше метод регулировки диаметра апертурной диафрагмы может показаться не очень удобным. По этой причине многие современные микроскопы оснащены специальной шкалой на конденсоре, позволяющей максимально комфортно и оперативно выполнять настройку. Нанесенная градуировка на конденсоре может быть выполнена в двух вариациях:

• Маркировка с указанием увеличения объектива. В таком случае Вам просто необходимо установить диафрагму в положение, соответствующее выбранному объективу.
• Маркировка с указанием числовой апертуры объектива. В таком случае необходимо установить диафрагму в положение, равное ≈65-80% от числовой апертуры используемого объектива.

*Заметка 8. При микрофотографии часто оказывается полезным использование светофильтров. Снижение напряжения и, как следствие, яркости изображения может привести к преобладанию в спектре теплых тонов из-за увеличения красной и уменьшения синей составляющих. Во избежание подобного явления для снижения интенсивности света рекомендуется использование нейтральных серых светофильтров, устанавливающихся перед конденсором. Кроме того, при исследовании образцов, для которых не очень важен цвет (например, хромосом), может оказаться полезным синий светофильтр, характеризующийся более короткой длиной волны и высокой разрешающей способностью. Таким образом, синий светофильтр повышает разрешающую способность микроскопа и улучшает качество картинки.

*Заметка 9. Выполнять процедуру настройки освещения по Кёллеру следует исключительно при визуальном наблюдении в окуляры, так как цифровые камеры для микроскопов характеризуются существенно более узким полем зрения, то наблюдая изображение на экране ПК, настройка освещение по Кёллеру будет менее точной и эффективной. Поэтому при занятии микрофотографией процедура настройки должна быть выполнена все равно при визуальном наблюдении.

Преимущества настройки освещения по Кёллеру

Что же собственно дает такая «утомительная» рутинная процедура, как настройка освещения по Кёллеру? Не вдаваясь в подробности и дебри науки, стоит сказать, что достоинствами осветительной системы по принципу Кёллера являются равномерное освещение объекта, возможность регулировки освещенности (числовой апертуры конденсора) и освещаемого поля объекта, а также обеспечение телецентрического хода лучей. Регулировка полевой диафрагмы влияет на величину освещаемого поля зрения, а регулировка апертурной диафрагмы – на яркость, контрастность изображения и разрешающую способность микроскопа.

В результате:

1. Во-первых, удается устранить нежелательные блики с боковых поверхностей тубуса микроскопа
2. Во-вторых, достигается равномерное освещение препарата по всему полю зрения
3. В-третьих, освещение осуществляется исключительно того участка препарата, который виден под микроскопом. Дополнительным плюсом здесь является и то, что таким образом уменьшается нагрев образца.
4. Устранение внутренних переотражений позволяет добиться наилучшего контраста, что особенно важно при занятии микрофотографией
5. Удается достичь максимального разрешения мелких деталей.

Таким образом, на сегодняшний день принцип освещения по Кёллеру является наиболее распространенной системой освещения в профессиональных лабораторных микроскопах, наиболее рациональным, сбалансированным и оптимальным методом освещения препарата.

Автор статьи: Галина Цехмистро